µLight : un autre éclairage sur la microscopie
Le Contraste de Phase Différentiel
  • Un objet parfaitement transparent n’absorbe pas la lumière et n’offre pas de contraste d’intensité lorsqu’on l’observe en lumière blanche : il est donc invisible. En revanche, quand l’indice de réfraction de l’objet diffère de celui du milieu environnant, il est possible de le rendre visible en utilisant une méthode de contraste de phase.
  • Il existe plusieurs méthodes de contraste de phase. La plus utilisée est la technique mise au point par F. Zernike (1888-1966), lauréat du prix Nobel de physique en 1953 pour ce travail. Cette méthode exige d’utiliser un condenseur et des objectifs particuliers. D’autres méthodes existent (DIC, contraste de Hoffman, holographie numérique) qui exigent aussi des composants spécifiques ou des calculs numériques complexes. 
    L’illumination oblique[1] est une alternative facilement utilisable avec µLightLT en définissant une structure d’illumination particulière : cette méthode permet d’observer les objets transparents. 
    En combinant deux images acquises avec deux structures symétriques, on obtient des images très contrastées dont l’intensité est complètement corrélée au contraste de phase[2]. 
Combinaison des méthodes
  • La figure ci-dessous illustre le potentiel de µLightLT avec des images d'un frottis sanguins non marqué.
  • Pour cette figure, l'illumination en lumière blanche spatialement cohérente permet d'obtenir l'image de gauche quand l'image de droite est obtenue en contraste de phase différentiel.
  • Les deux images sont obtenues en modifiant la structuration de l'illumination par le logiciel µLight CS.
  • On observe la complémentarité des deux méthodes : l'image en lumière blanche fournie des informations sur la densité optique et l'image en contraste de phase différentiel met en évidence les épaisseurs optiques locales, très visibles dans les leucocytes.
[1] Axelrod, D. “Zero-Cost Modification of Bright Field Microscopes for Imaging Phase Gradient on Cells: Schlieren Optics.” Cell Biophysics 3, no. 2 (June 1981): 167–73. doi:10.1007/BF02788132.

[2] Stewart, W. C. “On Differential Phase Contrast with an Extended Illumination Source.” Journal of the Optical Society of America 66, no. 8 (August 1, 1976): 813. doi:10.1364/JOSA.66.000813.
Masque de phase (gravure d'une lame de verre, motifs carrés de 2.5 µm de coté et 80 nm de profondeur). A gauche, image en contraste de phase conventionnel. A droite, en contraste de phase différentiel.
Images d'un frottis sanguin. A gauche : illumination en lumière blanche spatialement cohérente. A droite : contraste de phase différentiel. Objectif fond clair 40 X / 0.65.